新型冠状病毒N-蛋白检测试剂盒（酶联免疫法）说明书
【产品名称】
通用名称：新型冠状病毒N-蛋白检测试剂盒（酶联免疫法）
【包装规格】
96人份／盒
【预期用途】
本品定性检测血清或血浆样品中新型冠状病毒核衣壳（N）抗原。
传染性非典型肺炎，又称严重急性呼吸道综合症（Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS），是一种新出现的传染病[1]。SARS的致病原已于2003年4月16日由世界卫生组织确定为一种新的冠状病毒，命名为SARS冠状病毒（SARS－CoV）[2]。SARS自2002年11月首先在我国广东地区发生后，已在30多个国家和地区传播流行，造成了8422人感染，其中死亡人数为916（2003年8月7日前统计）[3]，根据现有资料[4-6]，该病主要通过呼吸道飞沫、体液及污物等方式近距离转播，有家庭聚集性和医院聚集性的特点。其主要的临床特征为起病急，发烧、咳嗽、肺部阴影、外周血白细胞不升高或者降低。尽管对病原体的研究取得了很大进展，但在病原生物学特性，发病机制，早期有效的诊断试剂、特异性治疗等方面的研究尚未获得突破性的进展，尚有一系列的问题需要解决。尤其是SARS早期诊断是困扰临床医生对该病及早发现、隔离及治疗等的一大难题，因为同一种病毒感染不同个体可表现出不同的临床特征，而不同的病毒感染又会出现相同的临床特征，所以，仅靠临床症状和流行病学资料很难确定病毒感染真正的病原，最终的确诊往往需要实验室的诊断，目前尚未有成熟的客观实验室诊断标准。由于大多数病毒性疾病尚没有特效治疗药物，实验室诊断已成为控制病毒性疾病流行和蔓延的重要手段。当务之急是尽快研究有效的诊断试剂，早诊断、早隔离、切断传播途径，控制疫情蔓延。
对于SARS冠状病毒感染的实验室诊断，目前主要包括以下几种方法：以PCR和基因芯片技术为基础的分子诊断；以抗体监测为基础的血清学诊断；以体外病毒培养为基础的病原生物学诊断。
目前，对SARS冠状病毒感染的实验室早期诊断主要是以PCR为基础的病毒核酸测定。现有的实验数据显示在发病14天左右病毒核酸的敏感性大约为70％[7，8]，由于病毒RNA容易降解，检测结果易受样品收集和处理的影响，而且样品污染可以造成假阳性，因此，需要严格的质量控制和经培训的技术人员熟练操作。另外需要专门的检测仪器并且价格昂贵，鉴于以上这些因素，有很多医院尚不能开展。
以特异性抗体监测为基础的血清学诊断，目前所采用的方法有两种：酶联免疫吸附法和免疫荧光法。血清抗体由阴性转为阳性以及从急性期到恢复期抗体滴度增加4倍以上表示感染是在近期发生的。由于特异性抗体在发病7～10开始出现，因此，抗体血清学检测不能用于SARS的早期诊断。
以体外病毒培养为基础的病原生物学诊断,从患者标本中分离到SARS-CoV是实验室诊断的“金标准”，但由于试验条件等的限制，一般不作为常规的方法。而且技术难度高，操作复杂，所需时间长，对设备要求高，不适于临床医院使用。
以特异性抗体为基础的病原学诊断，是对SARS实验室早期诊断的方法，是用已知的特异性抗体检测样品中病毒抗原。用特异性抗体建立病毒抗原诊断试剂盒的技术难度是需要特异性很高的单克隆抗体或多克隆抗体。成熟杂交瘤技术在多种疾病的免疫学诊断中已起到了巨大的作用，由于单克隆抗体具有高度特异的免疫学性质，可以构建高敏感特异的抗原检测试剂，这已被以往多种病毒抗原检测试剂所证实[9-11]。
由于已经证明SARS-CoV是一种正义单链RNA病毒。基因组结构分析表明，SARS-CoV基因编码结构蛋白由钉子糖蛋白（spike glycoprotein，S）、包膜小蛋白（small envelope，E）、膜蛋白（membrane，M）和核衣壳蛋白（nucleocapsid protein，N）等组成。尽管对这些结构蛋白的功能目前尚不清楚，但从冠状病毒生物学特性研究发现，病毒包膜上的蛋白很容易发生变异，而核衣壳蛋白却相对稳定，其抗原性比其他结构蛋白强，而且是病毒主要的抗原部分。因此，在获得高纯度、高特异性的病毒N抗原的基础上，免疫动物，从而得到高亲和力、高特异性的单克隆抗体和高效价多克隆血清，建立了测定SARS-CoV冠状病毒抗原的试剂盒。
【检验原理】
本品系用纯化的抗新型冠状病毒抗体（3株抗重组N蛋白的单克隆抗体）包被的微孔板和兔抗N蛋白抗原多抗、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG、阴性对照、阳性对照和显色液及其他必要辅助试剂制成，采用双夹心法ELISA原理：待测抗原与固相载体表面的抗体形成抗原抗体复合物，加入兔抗N蛋白抗体形成双抗体夹心免疫复合物，然后加入羊抗兔酶标记抗体，形成（抗体－N抗原－二抗－抗二抗酶标记物）免疫复合物，加入底物后在酶作用下产生颜色反应，通过仪器测定酶促反应的强弱即可定性检测待测样品中的N蛋白。
【主要组成成分】
1. 本试剂盒包含的组分：
序号 组分名称 主要成分 装量
1 预包被新型冠状病毒N蛋白单抗的微孔板 微孔板中预包被3株抗重组N蛋白的单克隆抗体。 96孔
2 兔抗SARS-COV N蛋白抗体 兔抗新型冠状病毒N蛋白免疫血清，Tris-NaCl缓冲液，含0.1% Proclin-300、0.001%苯酚红、蛋白稳定剂。 7.0mL×2支
3 HRP标记的羊抗兔IgG  辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG抗体，硼酸盐缓冲液，含0.1% Proclin-300、0.001%苯酚红、蛋白稳定剂。 7.0mL×2瓶
4 阳性对照 新型冠状病毒重组N蛋白，硼酸盐缓冲液，含0.02%硫柳汞、蛋白稳定剂。 1.0mL×1支
5 阴性对照 正常人血清或血浆，硼酸盐缓冲液，含0.02%硫柳汞、蛋白稳定剂。 1.8mL×1支
6 显色液A 柠檬酸、过氧化氢。 6.5mL×1瓶
7 显色液B 柠檬酸、四甲基联苯胺（TMB）。 6.5mL×1瓶
8 浓缩洗涤液（10倍） 磷酸盐缓冲液，含Tween-20，10倍浓缩。 50mL×2瓶
9 终止液 0.5 mol/L H2SO4溶液。 6.5mL×1瓶
10 密封袋  1个
11 封板膜  4片
12 记录纸  1份
注：兔抗SARS-COV N蛋白抗体、酶标记物、阳性对照、阴性对照，必须使用试剂盒配备的，不同批次不可混用。显色液A、显色液B、终止液、浓缩洗涤液为通用试剂，不同批次可以混用。
2. 需要但未提供的材料：
蒸馏水或去离子水
微孔板清洗器
5μL～40μL、40μL～200μL 、200μL～1mL移液器与一次性吸嘴
37℃恒温设备
微孔振荡器
酶标仪
60分钟或更长时程的计时器
【储存条件及有效期】
于2℃～8℃避光保存，有效期为6个月。
拆封后未用完的微孔板应放入密封袋内2℃～8℃保存。各组分拆封后应在一个月内用完。
生产日期、失效日期：详见标签。
【适用仪器】
具有450nm波长的酶标仪
【样本要求】
采样注意事项：因SARS冠状病毒有较强的传染性，能通过近距离密切接触传播，采集样本时必须做好充分的安全防护。采样容器用专用管架盛载。采完样后立即密封送检。此类标本应由专人专柜隔离保存。须标记清晰，切勿与其它病原体标本混放。采样过程应严格按《传染性非典型肺炎病例实验室检测标本采集技术指南》操作执行。
静脉采血后，室温放置1～2小时，离心分离出血清；如取血浆，采血后可直接离心分离血浆。如在24小时之内使用可于2℃～8℃中保存，长期存放应保存在－20℃以下，并避免反复冻融。高浓度的脂类、胆红素及溶血样本或微生物污染对测定结果的影响尚未确定。
血清样本或血浆样本于56℃灭活30分钟，对测定结果没有影响，其他灭活条件对测定结果的影响尚未确定。
【检验方法】
1.  试验过程注意事项
1.1  试剂盒各组分从冷藏环境中取出时，应在室温平衡至无潮气方可使用。不同批试剂组分不得混用。拆封后未用完的包被板应放入密封袋内保存。
1.2  试剂盒不要长时间放置于室温下，应于2℃～8℃保存，避免冰冻，并在有效期内使用。在储存及孵育过程中，应避免强光直接照射。所有试剂瓶盖须盖紧以防止蒸发和污染。
1.3  为避免试剂或样品的微生物污染及交叉污染，应使用一次性吸嘴，不要重复使用。
1.4  在取用对照品、兔抗SARS-COV N蛋白抗体和酶标记物之前应轻轻摇动使其充分混匀，加样前，使用微孔振荡器充分混匀样品。
1.5  严格遵守规定的孵育时间和温度。如果第一孔与最后一孔加样时间间隔太长，将会导致不同的“预孵育”时间，从而影响测量值的准确性及重复性。
1.6  洗涤结束时，应将微孔板倒扣于纸巾上并轻轻敲打，确保所有孔内均无残留洗涤液，避免产生泡沫。如果使用自动洗板机，应注意正确操作。
1.7  每次试验必须设阴性及阳性对照。
1.8  试验操作应严格遵守《传染性非典型肺炎实验室生物安全操作指南》。
2.  试验准备
2.1  试剂盒反应试剂准备
2.1.1  微孔条
将检测所需数量的微孔条固定于板架上，剩余的微孔条放入密封袋中保存。
2.1.2  洗涤液
在干净的量筒内稀释浓缩洗涤液。50mL浓缩洗涤液加入蒸馏水或去离子水至500mL，混匀。
2.1.3  其它液体组分
直接使用，使用前应轻轻摇动使其充分混匀。
2.2  样品准备
待检样品不用稀释，充分混匀后使用。测定临床样本时必须严格按照卫生部、科技部、国家食品药品监督管理局颁布的《传染性非典型肺炎病毒研究实验室暂行管理办法》。
3.  检测过程
3.1  每次实验每板须设空白孔1孔、阳性对照2孔、阴性对照3孔。空白孔不加样品、兔抗N蛋白抗体和酶标记物，只加洗液、显色液A、B和终止液；阳性对照、阴性对照直接使用，100L/孔。其余每孔加入样品100L。
3.2  加封板膜置37℃温育60分钟。
3.3  吸净孔中液体，洗板5次，每次停留30秒后甩净拍干。
3.4  除空白对照外每孔加兔抗N蛋白抗体100L，加封板膜置37℃温育60分钟。
3.5  吸净孔中液体，洗板5次，每次停留30秒后甩净拍干。
3.6  除空白对照外每孔加酶标记羊抗兔IgG抗体100L，加封板膜置37℃温育60分钟。
3.7  吸净孔中液体，洗板5次，每次停留30秒后甩净拍干。
3.8  拍干后各孔滴加显色液A、B各50L，置37℃避光10分钟，每孔立即加入终止液50L，轻微震荡微孔板以混合均匀。
3.9  以空白孔调零，用酶标仪读取450nm处的A值。
4.  质量控制
阳性对照A值平均值≥0.50，阴性对照A值平均值≤0.20，证明实验成立。
【阳性判断值】
临界值（CUT OFF）＝0.09＋阴性对照平均A值（当阴性对照平均A值小于0.10时，按0.10计算；当阴性对照平均A值大于或等于0.10时按实际值计算），结果判断如下：
样品A值＜临界值×0.8                   阴性
临界值×0.8≤样品A值＜临界值            可疑
样品A值≥临界值                        阳性
【检验结果的解释】
1. 本试剂盒临界值是依据检测1297例健康人血样及临床考核的检测结果而确定。
2. 本试剂盒的检测结果不是临床适应症的唯一确认指标，测定结果要密切结合临床指征及其他测定结果进行综合分析。
3. 可疑及阳性样品应进行第二次实验来复核，并进行双孔测定。
4. 对于检测结果阳性的报告，只表明该样品中有新型冠状病毒的蛋白存在，并不表明有活病毒存在，或病毒量足以感染其他人。
5. 临床考核结果表明，本品的测定结果会因采样时间的不同而异，因此检测为阴性的样品不能排除新型冠状病毒的感染。
6. 可疑样品除重复检测外，还应当对该病例进行高密度连续采样（如每天一次）并及时检测抗原，以期尽早地确定其是否感染；有条件时也应当追踪其更早期的血清标本并检测抗原，以排除已经错过其抗原峰值期的可能性；对于发病10天后的病例，应当同时进行抗体检测。
【检测方法的局限性】
1. 本品所用抗体系针对新型冠状病毒核衣壳蛋白，其灵敏度和特异性虽已进行了相关的实验室和临床研究确证，但鉴于目前对于SARS各发病阶段，病毒在人体各组织部位的分布及持续时间等方面的基础研究工作还有待深入，因此，其灵敏度和特异性还需进一步的研究与确证。
2. 试验结果虽然表明本检测系统与特异性项目中所列病毒的培养液无交叉反应性，但未进行这些病毒感染样本的临床考核。与其他（特异性项目中所列病毒以外）病原体的交叉反应尚没有实验数据。
3. 本试剂使用鼠单克隆抗体及兔多克隆抗体，因此阳性结果也可能是某些患者体内具有高滴度人抗鼠或人抗兔抗体所引起的，如诊断或治疗中接受过鼠单克隆抗体制剂的患者等。
4. 本品对临床确诊SARS患者连续监测的结果表明，只有在病程的早期（1～10天），本品才有相对较高的阳性检出率，而在发病晚期，本品检测结果多数为阴性。
5. 对于检测阴性的样本，不能完全排除样本中新型冠状病毒的存在。以下原因均可导致阴性结果：
5.1 患者并未感染新型冠状病毒，而是由其他并未测定过的病原体（如病毒、细菌、真菌等）引起发病。
5.2 由于检测灵敏度限制，造成假阴性结果。
5.3 样本中的病毒或病毒蛋白可能只在一定的时期内存在，样本并未在病毒或病毒蛋白存在时被采集。
6. 目前对血清高滴度抗体是否影响抗原检测结果还有待进一步研究。
【产品性能指标】
1. 外观
包装盒应整洁，产品批号和有效期正确清楚。液体组分应清亮，无沉淀物或絮状物。
2. 阴性参考品符合率
16份阴性参考品检测结果不得出现假阳性（16/16）。
3. 阳性参考品符合率
16份阳性参考品检测结果不得出现假阴性（16/16）。
4. 最低检出量
共7份，要求至少检测出4份为阳性样品，而且基质血清必须阴性，即4/7。
5. 精密性
用精密性参考品进行检测，CV（%）应不高于15％（n＝10）。
6. 稳定性试验
出厂前37℃放置3天后进行检测，其阳性参考品符合率、阴性参考品符合率、最低检出量和精密性均应符合要求。
7. 生物安全性
试剂盒中对照品要求HBsAg、HIV-Ab、HCV-Ab及梅毒螺旋体抗体检测为阴性。
【注意事项】
1．本品所有试剂均不具有传染性，但仍需按传染性物质对待。
2．任何临床样本都应作为具有传染性样品对待。各项试验要参照执行由科技部、卫生部、国家食品药品监督管理局、国家环境保护总局联合下发的《传染性非典型肺炎病毒研究实验室暂行管理办法》和《传染性非典型肺炎病毒的毒种保存、使用和感染动物模型的暂行管理办法》的有关规定。
3．样本的采集方法对采样人员有一定的危险性，采样人员应高度重视安全防护。
4．实验室中所有各种废弃物都应按传染物处理。实验中用过的吸头应直接打入盛有1%次氯酸钠的废物缸内，并与其它废弃物一同在指定的地点以指定的方式进行焚烧或毁弃。
5．试验结束后应立即清洁工作台。工作台及各种试验用品应定期用1%次氯酸钠、75%酒精或紫外灯进行消毒。
6．注意避免皮肤或黏膜直接接触试剂或样品。显色液中含TMB，终止液含硫酸。含TMB的试剂在试验中会诱发其它反应；含硫酸的试剂有腐蚀性。一旦接触到这些液体，应立即用水彻底清洗。
【标识的解释】
包装标签
的标识    
标识的含义 温度限制 体外诊断医疗器械 参考使用说明 不得二次使用
【参考文献】
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【基本信息】
注册人/生产企业名称：珠海经济特区海泰生物制药有限公司
住所：珠海市唐家湾镇港湾大道创新四路18号     邮政编码：519085
联系方式：电话号码：0756-3890858         传真号码：0756-3890848
售后服务单位名称：珠海经济特区海泰生物制药有限公司
联系方式：电话号码：0756-3890858         传真号码：0756-3890848
生产地址：珠海市唐家湾镇港湾大道创新四路18号     邮政编码：519085
生产许可证编号：粤食药监械生产许20040941号
【医疗器械注册证书编号/产品技术要求编号】国械注准20173401143
【说明书核准及修改日期】2017年6月28日